|
Ивашков Е.А.
В немалой степени успеху полимеразной цепной реакции (ПЦР) способствовало
появление на медицинском рынке высокотехнологичных коммерческих тест-систем,
значительно упростивших и ускоривших проведение реакции. В то же время
применение нового метода поставило и ряд вопросов, один из которых -
интерпретация результатов ПЦР.
Высокая чувствительность метода имеет и оборотную сторону - выявляемые
десятки и сотни копий микроорганизмов в пробе не всегда "достаточны" для
возникновения заболевания. Положительные результаты ПЦР в отсутствие клинических
признаков заболевания (нередко сопровождаемые отрицательными результатами других
лабораторных исследований) позволило "предъявить обвинения" этому методу в
гипердиагностике. Открытым остаётся вопрос о трактовке результатов контрольных
исследований методом ПЦР: качественный метод не позволяет достоверно оценить
динамику популяции возбудителя под влиянием проводимого лечения.
Тест-системы, создаваемые для количественного определения патогенов методом ПЦР,
либо обладают меньшей чувствительностью по сравнению с "качественными"
(большинство наборов с внутренним контролем), либо требуют значительно больших
затрат расходных материалов (метод последовательного разведения). Кроме того, в
условиях использования реального клинического
материала нередко наблюдаются парадоксальные ситуации, когда образцы с большим
содержанием определяемой ДНК дают более слабое свечение, чем пробы, бедные
"мишенями", и наоборот.
Целью данной работы была оценка эффективности качественного
определения возбудителей инфекций, передающихся половым путём (ИППП) на
основании сопоставления частоты их обнаружения до проведения лечения и по
окончании терапии.
Материалы и методы.
Материал (моча, соскобы из цервикального канала, уретры, эпителий из
заднего свода влагалища, аспираты из полости матки) получали от женщин,
обращавшихся за помощью к врачам-гинекологам женских консультаций г. Хабаровска.
Всего было обследовано 2112 человек, 1747 из них - при первичном посещении врача
и 365 - после проведения лечения. Количество анализов составило соответственно
6728, 6179 и 549. Контрольное исследование осуществляли не ранее, чем через 14
дней (для хламидий - не ранее одного месяца) после окончания терапии. Для
проведения ПЦР использовались российские диагностические тест-системы ("горячий
старт") по технологии, рекомендованной производителем наборов. Результаты
детекции документировались фотографированием геля на фотоплёнку "Микрат-300". За
счёт высокого коэффициента контрастности (? = 4,0) и длительной экспозиции
фиксировались полосы амплификата, недоступные для визуального различения. Данные
хранились и обрабатывались в СУБД MS Access 97.
Результаты и обсуждение.
Проведённое исследование показало, что Chlamidia trachomatis и Mycoplasma
hominis присутствовали соответственно в 20,5 и 31,8% исследованных образцов
(см.
Таблицу 1). Частота выявления этих микроорганизмов существенно не отличалась
во время первого посещения врача и при контрольном исследовании после лечения.
Кажущийся парадокс легко объясним: терапия была назначена тем женщинам, у
которых был обнаружен возбудитель заболевания, иначе говоря, - инфицированность
в этой группе первоначально составляла 100% а после проведения лечения снизилась
для микоплазм втрое и впятеро для хламидий.
M.genitalium в пробах, взятых до начала терапии, встречалась в 9,3% (в контроле
после лечения - 6,4%), U.urealiticum - 62,8% (53%). Персистенция
цитомегаловируса в цервикальном канале установлена в 21,1% (проводимое лечение
снизило этот процент до 13,3), вирус простого герпеса обнаружен в 18,3% (9,1%).
Приведённые результаты с определёнными оговорками позволяют оценить устойчивость
различных групп микроорганизмов к терапии (в частности, учитывая того, что
большой объём выборки по различным медицинским учреждениям нивелировал
особенности схем лечения). Так, практически при одинаковой частоте обнаружения
трихомонад и кандид до начала терапии (около 23%), первые впоследствии
идентифицированы только у 14,3%, а вторые выявлены у 40% лечившихся женщин.
Полученные данные хорошо вписываются в наблюдаемую нами в последнее время
картину: трихомониаз и гонорея, в отличие от других ЗППП, стали встречаться реже
(это же показывает и Российская статистика). В то же время, рецидивирующие
кандидозы и бактериальные вагинозы (БВ) стали настолько обычным явлением
(например, последние мы диагносцируем у 26% женщин), что некоторые врачи стали
считать их вариантом нормы. Что же показывает проведённое исследование?
Gardnerella vaginalis не только чаще других обнаруживает себя в генитальном
тракте женщин, но и делит пальму первенства по устойчивости к проводимой терапии
(50%) с U.urealiticum (53%) - вторым, едва ли не облигатным компонентом
биоценоза влагалища при БВ. О третьем компоненте - Mycoplasma hominis- было
сказано выше.
Понимая безусловную неприемлемость полуколичественной оценки ПЦР в каждом
отдельно взятом исследовании, мы предприняли попытку использовать данный метод
для сравнительной оценки относительно больших групп (женщин до начала лечения и
после его завершения). В этом случае девиации, связанные с наличием ингибиторов
термостабильной полимеразы и т.п. взаимно гасятся в обеих исследуемых группах,
поскольку начинают "работать" законы статистики для больших популяций.
Интенсивность свечения полосы продукта амплификации сопоставляли с
люминисценцией амплифицированного фрагмента соответствующей контрольной ДНК (4
балла, или 4+). Невидимой глазом, фиксированной только на фотоплёнке светящейся
полосе амплификата соответствовал 1+. Остальные градации занимали промежуточное
положение.
Результаты такого "полуколичественного" исследования приведены в Таблице.
Наиболее интересным нам представляется оценка интенсивности реакции в группе
хламидий. Если при первичном исследовании полосы продукта амплификации светились
довольно ярко (во все "балльные" интервалы попало приблизительно одинаковое
число проб), то в контрольном тесте явно преобладали крайне слабые (невидимые
глазом, но совершенно чётко зафиксированные на фотоплёнке) сигналы. "Видимые"
полосы составили в контроле менее трети от всех обнаруженных!
Как указывалось, контрольное исследование на хламидии проводили через месяц и
более после завершения терапии, когда происходило полное замещение клеток
призматического эпителия и элиминация находящихся в них погибших ретикулярных и
элементарных частиц хламидий. Проводимые контрольные исследования не показали
наличия полос в "отрицательных контролях". Поэтому приведённые выше результаты
не могут быть следствием технологических погрешностей.
По-видимому, приведённые факты должны побудить сделать соответствующие выводы
исследователей, игнорирующих применение фотографических или электронных
(чувствительная видеокамера? компьютер) технологий фиксации результатов
амплификации.
При трактовке результатов ПЦР врач должен учитывать современное состояние
вопроса: хламидийная инфекция коварна. Этот вид микроорганизмов представляет
собой реальную угрозу для женщины и ребёнка даже в минимальных количествах,
выявляемых молекулярно-биологическими методами.
Не существует чётких критериев степени опасности присутствия разного количества
CMV и HSV в цервикальном канале, но достоверно известно, что сам факт их
персистенции определяет значительно более высокий процент инфицирования ребёнка
в родах даже у серопозитивных, обладающих определённым иммунитетом, женщин. При
первичном инфицировании частота и тяжесть вирусных поражений многократно
возрастают.
Несколько сложнее трактовка выявления микоплазм. Известно, что, например,
уреаплазмы могут длительное время персистировать в урогенитальном тракте, не
вызывая видимых патологических изменений. Высокий процент обнаружения данного
вида микроорганизмов в наших исследованиях также косвенно свидетельствует об
отсутствии 100% патогенности. Учитывая побочные действия антибиотиков, при
отсутствии клинических проявлений обнаружение уреаплазм не должно служить
показанием к антибиотикотерапии (исключение - планируемая беременность - см.
ниже), может быть рекомендована коррекция иммунитета. Тем не менее, при
воспалительном процессе выявление уреаплазм в отсутствии других патогенов
позволяет считать их этиологическим фактором заболевания. Не располагают к
благодушию и приведённые выше результаты: U.urealiticum неожиданно
оказалась микроорганизмом, максимально устойчивым к проводимой терапии.
Многие исследователи указывают на взаимосвязь присутствия уреаплазм в
цервикальном канале беременных с преждевременным разрывом амниотической оболочки
и излитием околоплодных вод; профилактическая антибиотикотерапия уменьшала как
частоту выявления уреаплазм, так и риск преждевременных родов.
Таким образом, при выявлении потенциально патогенных бактерий и вирусов не
следует забывать о том, что болезнь есть взаимодействие микро- и макроорганизма.
Во многих случаях количественные критерии оказываются неприменимыми:
инфекционный процесс может быть гораздо более опасным в присутствии
относительного небольшого количества высокопатогенных возбудителей, при активном
синергизме патогенов, при временном ослаблении иммунной системы.
Всё это позволяет считать, что даже количественная модификация метода ПЦР может
и должна применяться при установлении этиологических факторов заболеваний
урогенитальной сферы.
Метод высоко информативен не только при первичной диагностике инфицирования
урогенитального тракта, но и при контроле излеченности от ИППП. В сочетании с
другими методами диагностики он даёт думающему врачу полную информацию для
принятия правильного решения.
* Ивашков Е.А. Место качественной модификации метода ПЦР в первичной
диагностике ИППП и контроле эффективности лечения . Сб. тез. докл. 3-й
Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной
медицине, Москва, 25-27 января 2000 г. ". М., 2000. с. 102-106.
Статья опубликована на сайте
http://www.rusmg.ru
|
