|
Алехин С.А. Липатов В.А.
Курский государственный медицинский университет, каф. хирургических болезней №
2, каф. оперативной хирургии и топографической анатомии
www.drli.h1.ru
Определение активности трипсина является важным критерием в диагностике острого
панкреатита. До настоящего времени основным методом определения активности
трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного
метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью
зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина
от его концентрации используемого для построения калибровочного графика,
сложность расчетов.
Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей
методики.
Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических
жидкостях.
Метод основан на расщеплении трипсином синтетического бесцветного субстрата —
бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина,
количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c
микрокюветами при длине волны 410 нм.
Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в
модификации Шатерника.
Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение
графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в
Microsoft Excel.
Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то
для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации
р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график.
Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно
также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.
Ход определения:
В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида
и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл
плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н
раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение
оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410).
Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит
помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить
оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные
помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре
370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность
раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные
данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).
Расчет активности трипсина производят в три этапа
1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна:
DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))
2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному
уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:
y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6
, где b и с константы
Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y =
874,45*x 1 + 84,94*x2
В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у –
количество образовавшегося р-нитроанилина.
В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального
уравнения для данных этой калибровки.
3. Непосредственно расчет активности трипсина.
Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и
плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то
и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.
Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения,
показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл
субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое
количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется
в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.
Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у
* 4) / 30.
Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает
расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации
Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с
отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений
активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет
находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение
количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике
плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл.
Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность
связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов.
Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и
построения калибровочного графика и их автоматизация. Использование уравнения
полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с
нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина
от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем
классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью
автоматизировать расчет, но и вести базу данных.
Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в
биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и
молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 -
59.
|
