|
Клинико-экспериментальное исследование
Д.м.н. Сопуев А.А., Колигов Б.М.
Национальный хирургический центр Кыргызской Республики, г. Бишкек
Несмотря на крупные достижения в хирургическом лечении больных острыми
холециститами эта проблема по-прежнему является одной из ведущих в неотложной
хирургии. Это объясняется ежегодным увеличением заболеваемости ОХ как в мире,
так и в Кыргызской Республике. Это свидетельствуют о том, что наши знания о
патогенезе ОХ не достаточны.
Влияние острого воспаления желчного пузыря на иммунитет изучалось и
продолжает изучаться до последнего времени. Установлено, что при ОХ в организме
больного развивается угнетение иммунитета, сопровождающееся уменьшением уровня
иммуноглобулинов и нарушениями клеточного иммунитета.
Тщательно в настоящее времени изучены показатели «кислородного градиента» при
ОХ. Установлено, что в организме при ОХ развивается гипоксемия.
Угнетение клеточного и гуморального иммунитета при ОХ объясняется влиянием
продуктов воспаления и нейрореципрокными воздействиями воспаленного ЖП на
организм. Вместе с тем в литературе имеются единичные исследования о влиянии
самого воспаленного ЖП на иммунитет и «кислородный градиент». В то же время это
затрудняет научное обоснование профилактики и лечение депрессии иммунитета и
гипоксемии при хирургическом лечении ОХ.
Цель работы: - изучение влияния гуморальных факторов желчного
пузыря больных хроническими калькулёзными, острыми катаральными, флегмонозными и
гангренозными холециститами после лапароскопической холецистэктомии на иммунитет
и «кислородный градиент» в эксперименте на кроликах.
Общая характеристика клинического материала. Клинико-лабораторные
исследования выполнены у 130 больных ОХ, поступивших в НХЦ МЗ КР за период
1999-2002 г.
В основной клинической группе было 130 больных ОХ: 61 больной хроническими
калькулезными холециститами (ХКХ), 12 больных острыми катаральными холециститами
(ОКХ), 45 больных острыми флегмонозными холециститами (ОФХ) и 12 больных острыми
гангренозными холециститами (ОГХ.
Из всех 130 прооперированных больных 114 составили женщины и 16 мужчины. ОКХ
у 11 женщин и 1 мужчины, ОФХ у 36 женщин и 9 мужчин, ОГХ у 4 мужчин и 8 женщин и
ХКХ у 59 женщин и 2 мужчин. Средний возраст больных составил 48,6±2,3 лет.
Все больные ОХ обследовались в момент поступления в НХЦ МЗ КР, на 1-е, 3-и,
5-е сутки и перед выпиской после ЛХЭ. Удаленные воспаленные ЖП больных
холециститами по формам ОХ накапливались и хранились в морозильнике при t-20° С.
В дальнейшем из этих ЖП по авторской технологии В.Х. Хавинсона, В.Г. Морозова
(1980) методом уксуснокислой экстракции выделено 9 пептидных фракций.
Методы и сроки клинико-лабораторных и экспериментальных исследований. На
микроаструпе «Compact-2» полуавтоматическом микропроцессорном анализаторе
определяли показатели кислотно-шелочного равновесия (КЩР): активность ионов
водорода (рН), парциальное давление двуокиси углерода (рСО2),
парциальное давление кислорода (рО2), избыток оснований (ВЕ), избыток
оснований во внеклеточной жидкости (BЕecf), буферная емкость (ВВ), бикарбонат
(-НСО3). Также изучалось содержание Т- и В- лимфоцитов, Т-супрессоров,
суммарный цитотоксический коэффициент, фагоцитарный показатель, среднее
количество частиц поглощенного латекса на одну клетку исходя из 100 клеток и
интегральный фагоцитарный индекс. Гуморальный иммунитет оценивали по
количественному содержанию IgА, IgM, IgY. Изучены 23 показателя
сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. Для контроля все
вышеуказанные показатели исследованы у 10 практически здоровых людей. В работе
также использовались общепринятые методики определения уровня гемоглобина (Нb),
числа эритроцитов, цветного показателя (ЦП), гематокрита (Ht), числа лейкоцитов
(L), лейкоформулы и СОЭ.
Характеристика экспериментального материала. Эксперименты проведены в
летне-осенний период 2000г на 70 беспородных кроликах обоего пола, массой от 2
до 3 кг. Все животные до экспериментов содержались в виварии не менее 2-х
недель, где они находились на обычном рационе, утвержденном ГОСТом для кормления
животных. Обследование иммунитета и «кислородного градиента» проводили до опытов
(фон), на 15-й день внутримышечного введения пептидных фракций, а также на 10-й,
20-й и 30-й дни (соответственно 25-й, 35-й, 45-й дни опыта) после окончания
15-ти дневного внутримышечного введения. Пептидные фракции в наших опытах
животным вводились внутримышечно в дозе 1 мг/кг массы тела. Перед введением
пептидные фракции разводились в стерильном физиологическом растворе. Препараты
вводились 1 раз в сутки в течение 15 дней. В качестве контроля (препарата
сравнения) 7 животным в таком же объеме вводился стерильный 0,9% раствор хлорида
натрия в те же сроки.
Работа с животными: До начала проведения экспериментов у животных
тщательно выстригали шерсть в паховой области левого бедра. В течение 2-х недель
до начала опытов каждый день один раз в сутки, каждое животное помещали на стол,
и после обработки 1% спиртовым раствором йода производили одноразовым шприцом с
иглой укол. Такая 2-х недельная тренировка животных позволила нам выработать
«динамический стереотип» у них поведения и исключить влияние болевого
постинъекционного стресса на изучаемые показатели.
Получение крови и плазмы: Кровь через силиконовый катетер из левого
желудочка сердца, a. и v. pulmonalis забирали в силиконированную посуду с
цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1 и тот час же центрифугировали в течение
10 мин. при 1500 об/мин. Полученную плазму сразу отсасывали в силиконированную
посуду и применяли в эксперименте. Кроме того, кровь помещали в кювету
электрокоагулографа Н–334 (333) и записывали показатели электрокоагулограммы.
Экспериментальные кролики были разбиты на следующие группы:
1. 7 животных, у которых был обследован общий фон, характеризующий состояние
клеточного, гуморального иммунитета и «кислородного градиента». Этим же животным
в дальнейшем вводился физиологический раствор (группа сравнения).
2. 7 кроликов, у которых было исследовано состояние иммунитета и
«кислородного градиента». Однако им в дальнейшем внутримышечно вводилась
пептидная фракция ХКХG1 в течение 15-ти дней.
3. 7 кроликов, которым после фонового обследования 15 дней внутримышечно
вводилась фракция ХКХG2.
4. 7 кроликов, подвергались, фоновому обследованию и им внутримышечно
вводилась фракция ХКХG3.
5. 7 кроликам после фонового обследования внутримышечно вводили пептидную
фракцию ХКХG4.
6. 7 кроликов также исследовали, до начала опытов и им внутримышечно
вводился, пептид ОКХG.
7. 7 кроликов после фонового обследования в течение 15 дней получали
внутримышечно инъекции пептидной фракции ОФХG1.
8. После фонового обследования 7 кроликов в течение 15 дней внутримышечно
получали пептидную фракцию ОФХG2.
9. После фонового обследования 7 кроликов внутримышечно получали пептидную
фракцию ОФХG3.
10. После фонового обследования 7 кроликам внутримышечно в течение 15-ти дней
вводили пептид ОГХG.
Полученный материал обработан по Стьюденту методами вариационной статистики
для связанных и не связанных между собой наблюдений и вычислен показатель
достоверности различий (Р).
Результаты собственных исследований. Из воспаленных удаленных ЖП больных
ХКХ после ЛХЭ выделяются 4, из ОКХ- 1, из ОФХ – 3 и ОГХ –1 пептидная фракция.
Все выделенные пептидные фракции обладают способностью влиять на показатели
«кислородного градиента» и иммунитета. У больных ХКХ с 44,3± 1,9 мм рт.ст.
увеличено до 46,2± 1,2 мм рт.ст. (P<0,05) р
СО2, уменьшен с 3,9± 0,1 ммоль/л
до 3,1± 0,1 ммоль/л (P<0,001) показатель ВЕ.
У больных ХКХ до операции выявляется алкалоз, гиперкапния, гипоксемия и снижение
показателей ВЕ, ВЕecf и ВВ. В первые сутки после ЛХЭ в организме этих больных
формировался ацидоз, продолжало нарастать рСО2 увеличивался
показатель ВЕ и уменьшался ВЕecf. Одновременно в крови больных выявлялась
эритроцитопения.
У больных ХКХ до операции выявлялось снижение клеточного и гуморального
иммунитета: снижалась интенсивность восстановления нитросинего тетразолия, СЦК,
уменьшалось число нейтрофилов способных осуществлять фагоцитоз, снижался уровень
IgA, IgM. Отметим также, что у больных до операции было с 51,2±
2,9% снижено до 48,2± 1,3% содержание
Т-лимфоцитов и увеличен с 108,8± 5,8 усл.ед.
до 116,7± 5,6 усл. ед. (P<0,05) уровень ЦИК.
В течении 1-х суток после ЛХЭ количество Т-лимфоцитов с 48,2±
1,3% возрастало до 53,1± 2,3% (P<0,05),
не изменялось процентное содержание В-лимфоцитов, Т-хелперов, падало содержание
Т-супрессоров, продолжал нарастать уровень ЦИК, сохранялась угнетенной
интенсивность восстановления нитросинего тетразолия и СЦК. Все 4 выделенные
пептидные фракции из ЖП больных ХКХ однонаправленно формировали в организме
кроликов алкалоз, так как рН уменшалась с 7,3±
0,0013 усл. ед. до 7,2± 0,01 усл.
ед., увеличивалась с 44,3± 1,9 мм рт.ст. до
49,1± 1,0 мм рт.ст. рСО2. Эта
гиперкапния на 25-й день опыта увеличивалась до 52,1±
1,1 мм рт.ст. (P<0,001), на 35-й день до 58,1±
1,1 мм рт.ст. (P<0,05). Одновременно эти фракции на 15-й день опыта четко
формировали в организме кроликов выраженную гипохромную анемию, так как ЦП с
0,9± 0,01 усл. ед. уменьшался до 0,8±
0,003 усл. ед. (P<0,05). У опытных кроликов все 4 пептидные фракции ХКХ
вызывали лейкоцитопению (P<0,05), не влияли на СОЭ и на процентное содержание в
лейкоформуле палочкоядерных, сегментоядерных лейкоцитов, эозинофилов и
моноцитов. Во всех 4 экспериментальных группах после 15-ти дневного
внутримышечного введения выделенных пептидов уменьшалось количество Т-лимфоцитов
(P<0,05), возрастал с 30,5± 1,1% до 35,4±
3,1% (P<0,05) уровень В-лимфоцитов, Т-хелперов (P<0,05), Т-супрессоров (P<0,05).
Одновременно пептидные фракции ХКХ в крови кроликов увеличивали уровень ЦИК (P<0,05),
снижали интенсивность восстановления нитросинего тетразолия (P<0,05). Также
уменьшалось количество лейкоцитов способных выполнять фагоцитоз с 44,2±
4,2% до 33,2± 4,0% (P<0,05) и до
32,4± 1,7% (P<0,05) на 15-й и 45-й дни
наблюдений. В крови опытных животных на 15-й день опыта с 3,1±
0,2 г/л уменьшался до 2,0± 0,2 г/л (P<0,001)
уровень IgA. Одновременно IgM снижался на 15-й и 45-й дни соответственно до 1,5±
0,1 г/л (P<0,05) и до 1,4± 0,1 г/л (P<0,05).
Таким образом, при ХКХ в организме больных развивается гипоксемия,
гиперкапния и накопление щелочных соединения. Из удаленных воспаленных ЖП
больных ХКХ выделяются 4 пептидные фракции, которые после 15-ти дневного
внутримышечного введения экспериментальным животным вызывают угнетение
клеточного и гуморального иммунитета, гипоксемию и гиперкапнию аналогичную у
больных ХКХ.
Из удаленных воспаленных ЖП при ОКХ выделяется 1 пептидная фракция. У больных
ОКХ в крови с 44,3± 1,9 мм рт.ст. до 46,0±
1,1 мм рт.ст. (P<0,01) увеличено рСО2. Уменьшены показатели ВЕecf (P<0,05),
ВВ (P<0,05) и довольно резко с 37,9± 1,8 мм
рт.ст. уменьшено до 26,7± 2,1 мм рт.ст. (P<0,001)
рО2. У больных ОКХ с 50,9± 1,9%
снижено до 40,1± 1,0% (P<0,05) количество
Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов (P<0,005). Эта Т- и В- лимфоцитопения сопровождалось
при ОКХ увеличением с 107,8± 5,1 усл. ед. до
118,2± 5,1 усл. ед. уровня ЦИК. Также до
операции и в течение 1-х суток после неё у больных ОКХ с 1,1±
0,1 был снижен до 0,7± 0,2 (P<0,05) и
до 0,9± 0,02 (P<0,01) СЦК. При ОКХ
уменьшается количество нейтрофилов способных к фагоцитозу (P<0,05), снижен
стандартный тест пожирания частиц латекса нейтрофилами (P<0,05). Показатели
гуморального иммунитета при ОКХ угнетены, уменьшается уровень IgA, IgM. 15-ти
дневное внутримышечное введение экспериментальным кроликам фракций, выделенных
из ЖП ОКХ формирует в организме животных алкалоз, накопление с 44,3±
1,9 мм рт.ст. до 50,0± 1,1 мм рт.ст.
(P<0,05) рСО2, уменьшение с 37,9±
1,8 мм рт.ст. до 28,3± 1,2 мм рт.ст. (P<0,05)
рО2 и снижение показателей ВЕ, ВEecf и ВВ. Одновременно в крови
опытных животных после введения этих фракций было снижено количество эритроцитов
(P<0,05), падал ЦП (P<0,05), не изменялось число лейкоцитов и СОЭ. Хотя
содержание в лейкоформуле лимфоцитов было увеличено (P<0,001). У всех животных,
которым вводились фракции ОКХG было снижено количество Т-лимфоцитов (P<0,001),
В-лимфоцитов (P<0,05), возрастало число Т-супрессоров (P<0,001), и уменьшался
уровень ЦИК (P<0,001). Депрессия клеточного иммунитета также подтверждается
уменьшением с 98,0± 0,4% до 0,5±
0,2% НСТ (P<0,001), снижением показателей ФП, ФЧ и ИФИ.
Таким образом, из ЖП ОКХ выделяется 1 пептидная фракция. В организме больных
ОКХ развивается депрессия клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемия и
гиперкапния. После 15-ти дневного внутримышечного введения выделенной из ЖП
больных ОКХ пептидной фракции в организме животных, также как и у больных ОКХ,
формируются депрессия клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемия и
гиперкапния.
Из ЖП при ОФХ выделены 3 пептидные фракции. У больных ОФХ в крови увеличено
содержание в крови соединений обладающих щелочными свойствами, имеется
гипоксемия и гиперкапния. Как правило, при ОФХ регистрируется выраженная
гипохромная анемия, снижены показатели клеточного и гуморального иммунитета. У
таких больных до операции с 51,2± 2,9 уменьшается до 45,1±
1,2 (P<0,001) содержание Т-лимфоцитов, не изменяется количество
В-лимфоцитов. Однако содержание Т-хелперов на 1-е и 3-и сутки после ЛХЭ
прогрессивно уменьшается, увеличивается уровень ЦИК (P<0,001), снижено
количество нейтрофилов способных к фагоцитозу (P<0,05). Уровень IgA при ОФХ был
уменьшен в крови с 3,8± 0,2 г/л до 2,4±
0,2 г/л (P<0,05). Уровень IgM при ОФХ был резко снижен как до операции (P<0,05),
так и 1-е (P<0,05) и на 3-и сутки после неё (P<0,05). Все 3 пептидные фракции,
выделенные из ЖП при ОФХ после 15-ти дневного внутримышечного введения кроликам
формировали алкалоз, гиперкапнию и гипоксемию. Одновременно эти пептидные
фракции увеличивали у кроликов такие показатели номограммы, как ВЕ, ВЕecf
соответственно до 5,2± 0,1 ммоль/л (P<0,001)
и до 4,0± 0,1 ммоль/л (P<0,001). В крови
опытных животных на 15-й день внутримышечного введения этих фракций
регистрировалась гипохромная анемия (P<0,05), лейкоцитопения и лимфоцитоз. Все 3
фракции ОФХ на 15-й день внутримышечного введения уменьшали количество
Т-лимфоцитов (P<0,001). Однако содержание В-лимфоцитов с 30,7±
1,2% возрастало до 38,6± 2,2% (P<0,05)
на 15-й день и сохранялось на уровне 33,2±
1,2% (P<0,05) на 25-й и 35-й дни опытов (P<0,05). Все 3 пептидные фракции ОФХ
значительно снижали у кроликов число лейкоцитов, способных к фагоцитозу (P<0,001).
Также были уменьшены такие показатели фагоцитоза опытных кроликов как ФП, ФЧ и
ИФИ (P<0,05). Содержание IgA на 15-й день опыта с 3,8±
0,2 г/л уменьшалось до 2,0± 0,1 г/л (P<0,05)
и продолжало падать до 1,6± 0,1 г/л (P<0,001)
на 25-й и до 1,5± 0,2 г/л (P<0,001) на 35-й
дни опыта. Уровень IgM и IgY также прогрессивно уменьшался на 15-й (P<0,05), на
25-й (P<0,001) и 35-й (P<0,001) дни.
Таким образом, в организме больных ОФХ регистрируется гипоксемия, гиперкапния
и накопление уровня щелочных соединений. Из ЖП при ОФХ выделяется 3 пептидные
фракции, которые после 15-ти дневного внутримышечного введения в организме
кроликов формируют сдвиги показателей «кислородного градиента», клеточного и
гуморального иммунитета аналогичные изменениям у больных при ОФХ.
У больных ОГХ выявляется при поступлении снижение с 37,9± 1,8 мм рт.ст. до
27,7± 2,1 мм рт.ст. рО2 (P<0,05),
увеличение с 4,3± 1,9 мм рт.ст. до 46,2±
1,1 мм рт.ст. (P<0,01) рСО2. Эти изменения показателей
«кислородного градиента» сохраняются в крови до 3-х суток после ЛХЭ. Также у
больных ОГХ выявляется уменьшение уровня Т-лимфоцитов (P<0,05), В-лимфоцитов (P<0,05),
Т-хелперов (P<0,05), Т-супрессоров (P<0,05). Эта депрессия клеточного иммунитета
подтверждается уменьшением с 98,0± 0,6% до
68,9± 1,1% НСТ(P<0,05) и СЦК (P<0,05). При
ОГХ снижается число лейкоцитов способных к фагоцитозу, так как ФП (P<0,05) и ФЧ
(P<0,05) снижены. У больных при ОГХ уменьшен уровень IgA (P<0,05), IgM (P<0,05).
Из ЖП больных ОГХ выделена 1 пептидная фракция. Внутримышечное введение этой
фракции в течение 15 дней у опытных животных вызывает изменения показателей
«кислородного градиента», клеточного и гуморального иммунитета аналогичные
больным ОГХ.
Влияние 15-ти дневного внутримышечного введения всех 9 выделенных пептидных
фракций прослеживалось в крови взятой из сердца, а. и v. pulmonalis. Если учесть
результаты наших предыдущих исследований и наши данные то, очевидно, что
пептидные фракции циркулируют в организме больных ОХ и экспериментальных
кроликов после 15-ти дневного введения. Согласно современным литературным данным
на мембране эритроцитов имеются специфические рецепторы, к которым могут
соединяться регуляторные пептиды. Мы в своем исследовании в качестве
мессенджер-системы выбрали гемостаз и изучили влияние in vitro выделенных
пептидных соединений на показатели свертывания крови. Оказалось, что при
комбинированном ведении нескольких пептидных фракций выявляется потенцирующий
эффект их влияния на показатели гемостаза. Оказалось, что в присутствии in vitro
все выделенные 9 пептидные фракции способны нарушать процессы присоединения и
отдачи кислорода в эритроцитах. Выделенные пептидные фракции циркулируют в крови
на мембране эритроцитов. 3-х кратное отмывание с физиологическим раствором
эритроцитов способно удалять эти пептидные фракции в промывочные воды. Мы
полагаем, что локализация гуморальных факторов воспаленного ЖП на мембране
эритроцитов обусловливают гипоксемию и гиперкапнию в организме больных ОХ,
сохраняющиеся даже на 3-и сутки после ЛХЭ. Эти выявленные нами факты
свидетельствуют о неэффективности нормобарооксигенотерапии у больных ОХ до
операции и в послеоперационном периоде. Результаты нашей работы позволяют
предложить важные для клиники практические рекомендации. Они заключаются в том,
что для эффективной коррекции иммунитета и показателей «кислородного градиента»
у больных ОХ при осложненном послеоперационном периоде, мы предлагаем эритроциты
больного 3-х кратно отмывать физиологическим раствором с последующей
аутореинфузией их.
Выводы:
1. У больных хроническими калькулезными, острыми катаральными, флегмонозными
и гангренозными холециститами до лапароскопической холецистэктомии выявляется
депрессия клеточного и гуморального иммунитета, гипоксемия, гиперкапния и
накопление в крови основных соединений.
2. Гуморальные факторы, выделенные из желчных пузырей у больных острым
холециститом, после 15-ти дневного внутимышечного введения в организме животных,
также как и у больных, формируют депрессию клеточного, гуморального иммунитета,
гипоксемию, гиперкапнию и накопление основных соединений в крови.
3. Выделенные гуморальные факторы циркулируют в крови больных острыми
холециститами и экспериментальных животных после 15-ти дневного внутримышечного
введения.
4. Эти гуморальные факторы воспаленных желчных пузырей в организме больных
острыми холециститами и экспериментальных животных локализуются в структуре
«белковой рубашки» эритроцитов.
5. Локализация этих гуморальных факторов в структуре «белковой рубашки»
эритроцитов нарушает процессы присоединения и отдачи кислорода, углекислоты в
организме больных острыми холециститами и экспериментальных животных, что
проявляется гипоксемией, гиперкапнией и накоплением основных соединений в крови.
Список терминологических сокращений
АКТ - аутокоагуляционный тест;
Ат III - антитромбин III;
ВВ - буферные основания;
ВЕ – избыток оснований;
ВЕecf – избыток оснований во внеклеточной жидкости;
ЖП – желчный пузырь;
ИФИ – интегральный фагоцитарный индекс;
КЩР – кислотно-щелочное равновесие;
ЛХЭ - лапароскопическая холецистэктомия;
НСТ – нитросиний тетразолий;
-НСО3 – бикарбонат;
ОКХG - пептидная фракция, выделенная из острых катаральных желчных пузырей;
ОФХG1,G2, G3 - первая, вторая и третья полипептидная фракция, выделенная из
острых флегмонозных желчных пузырей;
ОГХG - пептидная фракция, выделенная из острых гангренозных желчных пузырей;
ПДФ - продукты деградации фибрина;
П/я – палочкоядерные лейкоциты;
рН – активность ионов водорода;
СЦК – суммарный цитотоксический коэффициент;
С/я – сегментоядерные лейкоциты;
ТПГ - толерантность плазмы к гепарину;
ФА – фибринолитическая активность;
ФП – фагоцитарный показатель;
ХКХG1, G2, G3, G4 - первая пептидная фракция, выделенная из хронических
калькулезных желчных пузырей;
ЦП – цветной показатель;
IgA, IgM, IgY – иммуноглобулины.
|
